混合斑怎么提取精虫做DNA亲子鉴定(精虫亲子鉴定)

发布时间:2020-04-07 文章来源:安康生物

    1、接到案件检材后,首先肉眼观察可疑斑痕,剪取少量斑痕置于载玻片上加一滴蒸馏水浸泡,并放于保湿盒内10分钟,充分使斑痕浸泡出来,干燥,甲醇固定,用酸性品红亚甲兰染色镜检,并确定有精虫。


    用两步法提取精虫DNA.分别剪取适量检材斑痕,用3mlTES浸泡10分钟,加300μlSDS及30μl PK,充分混匀后放入37℃水浴中孵浴90分钟,在第一步消化女性成分中,中间补加20μl PK,并每间隔15分钟混匀30秒。3500转离心10分钟,上清备用,沉渣再用蒸馏水洗涤3次,沉渣涂片镜检观察有精虫,用三种方法分别抽提DNA.


    2.取100μl沉渣于1.5ml管中,加400μl TES,50μl SDS及12μl PK和30μl DTT,置于37℃水浴中过夜,依次用等体积的饱和酚、等体积的1:1酚/氯仿,等体积的氯仿抽提,水相中加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并置于-20℃冰箱中20分钟,离心去上清,用滤纸小心吸去残留在管壁的水分,加30μl去离子水充分混匀后置于100℃水浴中30分钟,即可进行PCR扩增检测。


    3.取100μl沉渣置于1.5ml管中,加200μl Chelex-100,12μl PK及30μl的DTT,充分混匀后置于100℃水浴中30分钟,12000转离心后,取上清进行PCR扩增检测。

混合斑怎么提取精虫做DNA亲子鉴定(精虫亲子鉴定)

    4.三种方法抽提的DNA与受害人、嫌疑人血样DNA一起同步扩增检测。PCR反应体系在20ul体系中进行。PCR缓冲液为50mmol/L KCL、10mmol/L Tris-Hcl、1.5mmol/L Mgcl、200mol/L dNTP,每组分别加0.5ulDNA,用本实验室自己合成的CSF1PO等14对引物进行检测,置于扩增仪中95℃4分钟后88℃条件下加入1u的DNA聚合酶,95℃15秒,60℃15秒,72℃45秒,循环14次,在90℃15秒,60℃15秒,72℃45秒循环16次,95℃5分钟后备检。


    5.聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳90分钟,AgNO3染色,碳酸钠显色。有机法提取DNA过程中,利用DNA只溶于水,而难溶于有机溶剂这一特性,用有机溶剂进行萃取,清除检材中脂类、色素、染料等,并使蛋白质(酶类)变性,使DNA得以浓缩纯化,但其有不能有效地祛除金属离子对扩增的影响及步骤繁琐,污染机会多,DNA损失等缺点;


    5%的Chelex-100法,是利用Chelex-100具有较强的金属离子亲和力,能彻底地螯和金属离子,清除金属离子对扩增的抑制,并防止DNA的降解,而且方法简便快捷,并在100℃煮沸30分钟的条件下使精虫细胞膜得以破裂,精虫DNA得到有效释放,其缺点是检材中的高浓度金属离子、色素、染料、脂类、蛋白质等成分不能清除,DNA未得到浓缩。


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