亲子鉴定pcr检测原理,多重引物PCR扩增?

发布时间:2020-06-09 文章来源:安康生物

    亲子鉴定pcr检测原理,多重引物PCR扩增?微卫星(microsatellite analysis)即短串联重复序列(Short tandem repeat,STR),它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列,通常扩增获得的多态性长度片段范围在100-400bp之间。STR基因座广泛地存在于哺乳动物基因组中,以人类基因组为例,平均每15-20kb就存在1个STR座位,据此估计整个人类基因组中大约有50,000-100,000个STR位点。由于STR位点具有高度的多态性和稳定的遗传性,因此较适合于作为遗传学DNA分子标记,目前STR分析已广泛应用于遗传制图、性状连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位和物种多态性研究等诸多领域。


    1985年,Mullis发明了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR), 使DNA的体外复制变成了现实。1988年,Saiki 等将耐热DNA聚合酶引入PCR,提高了扩增反应的特异性和效率,简化了操作程序,并实现了DNA扩增的自动化,迅速的推动了PCR技术的应用和普及。PCR能够在体外快速、特异性的扩增靶DNA,已成为当今最重要的分子生物学技术之一。法医物证应用PCR技术扩增人类基因组DNA中高度多态性位点,扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析研究不同个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律,在个人识别、亲子鉴定中发挥了重要作用。

亲子鉴定pcr检测原理,多重引物PCR扩增?

    但如何实现在一个反应管中多个STR位点同时均一稳定的扩增,却一直是科研界的一个难题。中德生物经过长时间的研究,通过对目标靶基因区域的选择,引物设计的优化,电子PCR,多重侯选引物的软件分析,反应参数的优化等方法,最终建立了稳定的多重STR-PCR扩增技术平台,并在此技术平台基础上开发了"STR银染基因分型扩增试剂 盒","STR荧光基因分型扩增试剂盒""宠物犬STR银染基因分型扩增试剂盒"产品。同时在此技术平台基础上正在开发食品安全领域的相关检测试剂盒,如饲料中牛、羊、猪肉组织成分检测系统。


    提高PCR反应特异性的方法


    引物的设计


    引物最好在模板cDNA的保守区设计,长度15-30bp,GC含量小于60%,端不超过连续三个G或C,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行BLAST检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。


    降落PCR


    降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使PCR效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高PCR的特异性和效率。


    热启动扩增


    采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高PCR反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将PCR仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有DNA链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性,而最有效的方法就是使用热启动酶或高保真酶去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到95℃时恢复活性,指导扩增。


    巢式PCR


    采用巢式PCR进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通PCR,然后将第一轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。

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